外泌體是由細(xì)胞分泌的富含蛋白質(zhì)的小膜囊泡。考慮到外泌體在不同生理活動(dòng)中的重要作用以及在診斷藥物遞送方面的潛在價(jià)值，研究者們?cè)隗w外追蹤和內(nèi)容物分析方面投入了大量的精力。近年來，各種超分辨率的出現(xiàn)為外來體的研究提供了強(qiáng)有力的工具。在這里，研究者展示了基于單分子定位的超分辨率成像技術(shù)（PALM/STORM）在癌癥來源的外泌體的成像和跟蹤中的應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)中，首先，從腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中提取癌癥來源的外泌體。然后，外泌體膜受體用光可切換探針標(biāo)記，其允許通過光激活定位顯微鏡（PALM）或隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）對(duì)這些膜受體進(jìn)行超分辨率成像。通過使用人乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體，研究者展示了外泌體膜上的兩種膜受體的同時(shí)雙色PALM/STORM成像。此外，外泌體的成功標(biāo)記和成像使得可以觀察癌癥來源的外泌體與正常細(xì)胞之間的相互作用。同時(shí)，研究者利用PALM/STORM成像實(shí)現(xiàn)了癌源性外泌體和溶酶體在受體細(xì)胞中的共定位。由于外泌體在細(xì)胞間通訊中起著至關(guān)重要的作用，研究者預(yù)計(jì)所提出的基于PALM/STORM的外泌體成像和跟蹤在研究外泌體介導(dǎo)的癌癥轉(zhuǎn)移機(jī)制中具有巨大的潛力。

#01研究介紹

外泌體是直徑為30-100 nm的小細(xì)胞外囊泡（EV）。外泌體由多種培養(yǎng)的細(xì)胞在多泡體（MVB）與細(xì)胞膜融合時(shí)分泌。由于它們的來源，外泌體富含蛋白質(zhì)的子集，包括四跨膜蛋白家族的成員（CD 9、CD 63和CD 81）、內(nèi)體運(yùn)輸?shù)鞍椎某蓡T（ESCRT相關(guān)蛋白/阿利克斯）和熱休克蛋白Hsp 60、Hsp 70和Hsp 702。這些小囊泡代表了細(xì)胞間通訊和物質(zhì)交換（例如胞質(zhì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的遞送）的重要方式，而沒有直接的細(xì)胞間接觸，并且對(duì)于一些實(shí)際臨床應(yīng)用（例如診斷和藥物遞送）是潛在的。幾個(gè)世紀(jì)以來，光學(xué)顯微鏡極大地促進(jìn)了我們對(duì)分子和細(xì)胞生物學(xué)的理解以及對(duì)外泌體的研究。與其他成像技術(shù)相比，的突出優(yōu)勢(shì)是其與樣品的兼容性，這確保了非侵入性成像和高生化特異性。然而，對(duì)于常規(guī)光學(xué)顯微鏡來說，幾百納米的中等分辨率限制了外來體的準(zhǔn)確定位和成像，因?yàn)樗鼈兊某叽缦鄬?duì)較?。ā?00 nm）。近年來，一系列新穎的光學(xué)超分辨成像技術(shù)克服了光學(xué)衍射極限。具體地，通過單分子定位顯微鏡已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了20 nm至50 nm的橫向成像分辨率，這有利于可視化超小細(xì)胞結(jié)構(gòu)。典型的光學(xué)超分辨成像技術(shù)包括近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微鏡（NSOM）、受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡 、光激活定位顯微鏡（PALM）、隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）等，其中PALM和STORM共享類似的工作原理。首先，進(jìn)行具有光可切換性質(zhì)的單個(gè)熒光團(tuán)的順序成像和定位。然后，可以從這些激活的熒光團(tuán)的位置重建具有亞衍射極限分辨率的圖像。到目前為止，許多具有不同光開關(guān)原理的熒光團(tuán)已被用于基于單分子定位的超分辨率顯微鏡，包括有染料，熒光蛋白，和量子點(diǎn)。如今超分辨率顯微鏡已被用于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定性或定量分析。隨著多色、3D和成像的進(jìn)步，這項(xiàng)技術(shù)在構(gòu)建納米尺度的細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖和提供以前未解決的生物結(jié)構(gòu)和過程細(xì)節(jié)方面具有巨大潛力。在不同的超分辨率成像技術(shù)中，PALM/STORM可以提供最高的分辨率（20-50 nm），這很好地適合外泌體的大小。在此，研究者展示了PALM/STORM技術(shù)在癌癥來源的外泌體的成像和追蹤中的應(yīng)用。第一次，外泌體描繪和跟蹤細(xì)胞內(nèi)的超分辨率顯微鏡。

#02結(jié)果和討論（節(jié)選）

2.1.外泌體的分離和TEM分析

在實(shí)驗(yàn)中，使用兩種癌細(xì)胞系，即人乳腺癌細(xì)胞（SKBR 3細(xì)胞）和人宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）。由于其小尺寸，外泌體純化曾經(jīng)是具有挑戰(zhàn)性的。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了用于從細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液或其他生物流體純化外來體的可靠且方便的方法，包括超速離心、超濾、在抗體偶聯(lián)的磁珠上捕獲、和基于聚合物的沉淀。對(duì)于特定的應(yīng)用，具有不同隔離結(jié)果的每種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。 外泌體的純化基本上通過基于聚合物的沉淀完成。 考慮到它們的小尺寸（30至IOOnm），外泌體可以用電子顯微鏡表征，并且提取的 外泌體 在圖1中可視化。 TEM結(jié)果證實(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)基中成功提取了外泌體 。

圖1 從HeLa細(xì)胞（a）和SKBR3細(xì)胞（b）分離的外來體的透射電子顯微鏡（TEM）圖像

2.2基于PALM/STORM的癌癥來源的外來體的超分辨率成像

2.2.1.HeLa外泌體中CD63的超分辨率成像

單個(gè)HeLa衍生的外來體的成像結(jié)果示于圖2中。在膜染料CM-Dil的幫助下，研究者可以鑒定外泌體的存在。圖2b示出了通過用561 nm激光激發(fā)CM-Dil的外來體的圖像。在定位外泌體后，進(jìn)行這些外泌體的PALM/STORM成像，結(jié)果示于圖2c中。圖2c的左下圖是從15000幀重建的CD 63的PALM/STORM圖像。而圖2c的右上圖是如圖2b所示的相同區(qū)域的寬場(chǎng)TIRF圖像。顯然，與TIRF圖像相比，PALM/STORM圖像提供了高得多的空間分辨率。從免疫熒光樣品中獲得了特異性的進(jìn)一步證據(jù)。通過用PBS替換兔抗CD 63抗體并保持其他程序和反應(yīng)條件不變來制備對(duì)照樣品。對(duì)照樣品的結(jié)果示于圖2d和2 e中。CM-Dil通道證實(shí)了外來體的定位，然而，觀察到Alexa Fluor 647的熒光可忽略不計(jì)（圖2 e）。這充分證明了在沒有一抗的情況下，Alexa Fluor 647標(biāo)記的二抗不能與外來體膜蛋白反應(yīng)。結(jié)果，在圖2c中觀察到的Alexa Fluor 647的熒光真正來源于CD 63，并且IF反應(yīng)顯示出良好的特異性。根據(jù)圖2g和2 h中所示的PALM/STORM成像的外來體的橫截面圖，外泌體的最終重建超分辨率圖像達(dá)到70 nm的半峰全寬（FWHM），這與外泌體的直徑（30-100 nm）很好地對(duì)應(yīng)。相反，CD 63的TIRF圖像遠(yuǎn)大于單個(gè)外來體的大?。▓D2f和2 h）。這證明與常規(guī)寬場(chǎng)TIRF相比，PALM可以提供更可靠的外泌體結(jié)構(gòu)信息。

圖2 HeLa外來體的TIRF和PALM/STORM成像

(a)用CM-Dil染色的CD 63和外來體膜的間接IF標(biāo)記的示意圖。(b)用CM-Dil染色的HeLa衍生的外來體的TIRF圖像。(c)用Alexa Fluor 647標(biāo)記CD 63，常規(guī)衍射限制圖像（右上）和PALM/STORM圖像（左下）。(d)不含特異性檢測(cè)用一抗的免疫熒光對(duì)照樣品，CM-Dil通道。(e)不含特異性檢測(cè)用一抗的免疫熒光對(duì)照樣品，Alexa Fluor 647通道。(f)單個(gè)外泌體上CD 63的寬場(chǎng)TIRF圖像。（g）（f）中相同區(qū)域的PALM圖像。(h)f和g中示出了外泌體的橫截面輪廓。傳統(tǒng)顯微鏡的分辨率約為幾百納米，大約是亞細(xì)胞區(qū)室的大小，因此不足以確定許多細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的納米級(jí)位置和數(shù)量。外泌體的PALM/STORM成像的優(yōu)越性可以通過對(duì)兩個(gè)相鄰的外泌體進(jìn)行成像來更好地證明。如圖3所示，呈現(xiàn)了兩個(gè)緊密堆積的外來體上的CD 63的TIRF和PALM/STORM圖像。根據(jù)兩個(gè)外泌體的截面輪廓，由于衍射極限，常規(guī)TIRF顯微鏡無法識(shí)別這兩個(gè)緊密堆積的外泌體。而PALM/STORM圖像清楚地顯示了兩個(gè)外泌體的存在定位。因此，由于能夠分辨超出細(xì)胞器水平的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，PALM/STORM已經(jīng)滿足了外來體的納米級(jí)定位精度，即使它們彼此相鄰。

圖3兩個(gè)相鄰?fù)鈦眢w的成像（a）常規(guī)TIRF圖像;（B）PALM/STORM圖像

2.2.2.SKBR 3外泌體中CD 63和HER 2/C-erbB-2的雙色超分辨成像

熒光顯微鏡的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)是通過用光譜上不同的熒光團(tuán)標(biāo)記兩種或更多種成分同時(shí)成像的優(yōu)異性能。在癌癥疾病的研究中，同時(shí)監(jiān)測(cè)不同的受體/生物標(biāo)志物可以提供關(guān)于患者的生理狀態(tài)的更可靠的信息。例如，乳腺癌的診斷需要同時(shí)分析各種受體/生物標(biāo)志物，例如人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER 2）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、雌激素受體（ER）和孕酮受體（PR）。由于外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用，因此外泌體上不同受體的同時(shí)成像可以為研究外泌體介導(dǎo)的癌癥轉(zhuǎn)移提供信息。因此，證明了外泌體上兩種受體的同時(shí)雙色PALM/STORM成像。為了實(shí)現(xiàn)雙色PALM/STORM成像19，除Alexa Fluor 647外，還使用了Alexa Fluor 488。先前的研究表明，Alexa Fluor 488也適用于PALM/STORM成像。此外，它的熒光信號(hào)可以很好地與Alexa Fluor 647區(qū)分開來，這可以大大防止雙色成像中的串?dāng)_。來源于SKBR 3細(xì)胞的外泌體在此用作模型外泌體，并且待成像的靶受體是CD 63和HER 2（人表皮生長(zhǎng)因子受體-2）。由C-erbB-2/HER 2陽性腫瘤細(xì)胞系SKBR 3釋放的外來體表現(xiàn)出HER 2/C-erbB-2過表達(dá)。此處，如材料和方法部分中所述，CD 63用Alexa Fluor 647 IF標(biāo)記，HER 2用Alexa Fluor 488 IF標(biāo)記。為了構(gòu)成有效標(biāo)記的額外證據(jù)，我們使用顯微鏡的波長(zhǎng)掃描功能來描繪Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647和CM-Dil標(biāo)記的外來體的熒光發(fā)射強(qiáng)度。與理論分析一致，兩種染料的熒光信號(hào)可以很好地區(qū)分，這防止了多色成像中的串?dāng)_。外泌體膜用CM-Dil染色。此處還添加空白對(duì)照以證明IF的特異性。雙色PALM/STORM成像結(jié)果見圖4。紅色通道是CD 63，綠色通道是HER 2，黃色通道是外來體膜?？梢钥闯觯珹lexa Fluor 488和Alexa Fluor 647的熒光信號(hào)都可以在SKBR 3外來體上檢測(cè)到（圖4a、d和b、e）。雖然在空白對(duì)照中沒有檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于這些熒光團(tuán)的熒光（圖4g和h），但證實(shí)IF標(biāo)記具有優(yōu)異的特異性并且雙色標(biāo)記是成功的。與圖4d和4 e中所示的PALM/STORM圖像相比，圖4a和4 b中所示的寬場(chǎng)TIRF圖像表現(xiàn)出不令人滿意的分辨率。圖4f中所示的合并的雙色PALM/STORM圖像表明CD 63和HER 2都在SKBR 3外來體上表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用PALM/SORM和IF技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)外泌體上不同蛋白質(zhì)的同時(shí)雙色超分辨率成像。

圖4 SKBR 3衍生的外來體中CD 63和HER 2的雙色超分辨率成像

用Alexa Fluor 647對(duì)CD 63進(jìn)行熒光標(biāo)記，常規(guī)衍射受限圖像（a）和PALM/STORM圖像（d）。用Alexa Fluor 488對(duì)HER 2進(jìn)行熒光標(biāo)記，常規(guī)衍射受限圖像（b）和PALM/STORM圖像（e）。(c)用CM-Dil染色的SKBR 3衍生的外泌體膜。(f)兩個(gè)超分辨率通道的合并圖像。(g-i)空白對(duì)照樣品，Alexa Fluor 647通道（g）、Alexa Fluor 488通道（h）和CM-Dil通道（i）的熒光圖像。通過超分辨率成像細(xì)胞內(nèi)追蹤癌癥來源的外來體最近的研究表明外來體在不同的生理和病理過程中起重要作用，例如免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥。由于外泌體的功能取決于它們與受體細(xì)胞相互作用的能力，因此研究已經(jīng)非常重視外泌體攝取的機(jī)制。在遇到它們的目的地時(shí)，外泌體可以與受體細(xì)胞的膜融合，然后將內(nèi)容物直接釋放到細(xì)胞質(zhì)中或通過內(nèi)吞途徑有效地內(nèi)化。最近的報(bào)告表明,腫瘤細(xì)胞可以釋放液(富含蛋白質(zhì)和rna)的一個(gè)子集為pre-metastatic利基preparation瀑特異性細(xì)胞。調(diào)查的細(xì)胞間tumor-derived液囊和正常細(xì)胞之間的通信是一個(gè)液的主要工作理解角色在威脅生命的癌癥轉(zhuǎn)移。所以我們用人類胚胎肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)作為模型正常細(xì)胞觀察的細(xì)胞吸收SKBR3液由正常細(xì)胞,可以更好的展示超分辨率成像技術(shù)的潛在應(yīng)用液相關(guān)的生物過程的研究。在實(shí)驗(yàn)中,CD63 SKBR3液如果貼上Alexa螢石647,和外來體膜沾CM-Dil在材料和方法部分描述。然后他們被MRC-5培養(yǎng)細(xì)胞。MRC-5細(xì)胞的膜與PKH67染色。孵化后1小時(shí),對(duì)這些MRC-5細(xì)胞進(jìn)行TIRF和PALM/STORM成像。在圖5中,研究者意識(shí)到內(nèi)化的colocalization SKBR3液和MRC-5細(xì)胞。如圖5 c和d,獲得了更高的空間分辨率成像,通過手掌/風(fēng)暴更準(zhǔn)確地觀察和細(xì)胞內(nèi)液的分布與傳統(tǒng)相比TIRF形象。圖5 e顯示了合并TIRF MRC-5單元的圖像和棕櫚/風(fēng)暴的形象內(nèi)化SKBR3液,這清楚地表明,這些SKBR3液已經(jīng)被MRC-5細(xì)胞。此外,如擴(kuò)大區(qū)域如圖5所示,執(zhí)行的外來體膜受體超分辨率成像比傳統(tǒng)TIRF圖像。所以研究者相信,棕櫚液胞內(nèi)可以提供更可靠的位置信息可視化。

圖5 SKBR 3外泌體的細(xì)胞內(nèi)追蹤

(a)PKH 67染色的MRC-5細(xì)胞的TIRF圖像（綠色）。(b)CM-Dil染色的SKBR 3外來體的TIRF圖像（黃色）。(c)內(nèi)化的SKBR 3外來體的常規(guī)TIRF圖像。(d)如（c）中所示的相同區(qū)域的PALM/STORM圖像。(e)MRC-5細(xì)胞（綠色）和內(nèi)化的SKBR 3外來體（紅色）的共定位。以及外泌體膜受體的放大的TIRF圖像（右上）、CM-Dil染色的外泌體（中右）和單個(gè)外泌體的PALM/STORM圖像（右下）。

先前的研究表明細(xì)胞攝取外來體依賴于內(nèi)吞作用和吞噬作用，一旦內(nèi)吞，大量外來體隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中進(jìn)行降解。然而，常規(guī)熒光顯微鏡的中等分辨率阻礙了對(duì)外來體的溶酶體運(yùn)輸?shù)闹苯颖O(jiān)測(cè)。在這里，使用PALM/STORM成像，研究者進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了MRC-5細(xì)胞的內(nèi)化SKBR 3外泌體和溶酶體的共定位。類似地，用Alexa Fluor 647 IF標(biāo)記SKBR 3外來體，并用LysoTracker Red標(biāo)記MRC-5的溶酶體。MRC-5的膜用PKH 67染色。由于兩個(gè)原因，選擇LysoTracker Red作為溶酶體染料。首先，它對(duì)溶酶體的酸性膜具有高度選擇性。其次，它可以通過561 nm照明成像和關(guān)閉，并通過405 nm光重新激活，這使得它適合于PLAM/STORM成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。觀察到外泌體和溶酶體的良好共定位，這意味著大部分外泌體定位在溶酶體內(nèi)。此外，如圖6 e中放大的雙色PALM/STORM圖像所示，在溶酶體內(nèi)部清楚地看到外來體.所獲得的超分辨率圖像為以下結(jié)論提供了更有力的證據(jù)：在與受體細(xì)胞結(jié)合后，外泌體將被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中以進(jìn)一步降解。

圖6 SKBR 3外來體和MRC-5溶酶體的共定位

(a)內(nèi)化的SKBR 3外泌體（紅色）和MRC-5膜（藍(lán)色）的TIRF圖像。(b)如（a）中所示的相同區(qū)域的PALM/STORM圖像。(c)MRC-5溶酶體（綠色）和MRC-5膜（藍(lán)色）的TIRF圖像。(d)如（c）中所示的相同區(qū)域的PALM/STORM圖像。(e)MRC-5溶酶體（綠色）和內(nèi)化的SKBR 3外來體（紅色）的共定位。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，即使在被其他細(xì)胞攝取后，標(biāo)記的外泌體的PALM/STORM成像仍然可以實(shí)現(xiàn)，并且內(nèi)化的外泌體的分布可以通過所提出的基于PALM的方法直接可視化，這表明PALM/STORM技術(shù)在研究外泌體及其內(nèi)容物（即miRNA、DNA、蛋白質(zhì)等）的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)中的潛在應(yīng)用。

#03結(jié)論

使用IF和PALM/STORM技術(shù)實(shí)現(xiàn)癌癥來源的外來體的基于單分子定位的超分辨率成像。與傳統(tǒng)的視場(chǎng)顯微鏡相比，PALM/STORM為觀察外來體提供了更好的空間分辨率，其尺度可達(dá)納米級(jí)。此外，還呈現(xiàn)了癌癥來源的外泌體的同時(shí)雙色PALM成像。通過與傳統(tǒng)的寬視野顯微鏡相比，很明顯，使用PALM/STORM成像技術(shù)，研究者可以更精確地可視化摻入的外泌體的細(xì)胞內(nèi)位置。因此，PALM/STORM是一種新的強(qiáng)大的方法，用于細(xì)胞內(nèi)跟蹤外來體和其他納米結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)異的空間分辨率。此外，憑借這些優(yōu)異的特性，我們有充分的理由相信，超分辨率成像將非常適用于后續(xù)的外泌體和外泌體相關(guān)生理過程的研究。