跨膜糖蛋白Trop2與許多上皮癌有關(guān)。它不僅在促進(jìn)胎兒肺生長(zhǎng)方面發(fā)揮作用，還參與腫瘤發(fā)生、惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤播散。然而，Trop2在分子水平上的詳細(xì)分布仍然未知。本文使用直接隨機(jī)光學(xué)重建揭示了Trop2在培養(yǎng)和原代肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞膜上的空間組織。所有類型的癌細(xì)胞都比正常細(xì)胞呈現(xiàn)更多的Trop2定位。通過(guò)SR-Teseller聚類分析，我們發(fā)現(xiàn)Trop2以簇的形式存在于所有膜上;然而，癌細(xì)胞產(chǎn)生的簇比正常細(xì)胞更多，由更多的分子組成。本研究結(jié)果揭示了膜Trop2的異質(zhì)分布，突出了肺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞之間膜Trop2聚集特征的顯著差異，為進(jìn)一步研究Trop2聚集在肺癌中的機(jī)制和功能奠定了基礎(chǔ)。

研究結(jié)果（節(jié)選）

1.Trop2在不同培養(yǎng)細(xì)胞上的高分辨率成像

NSCLC主要包含三種類型，每種類型中選擇一種細(xì)胞作為代表：A549代表ADC，sk-MES-1代表SqCC，H460代表LCC。由于NSCLC是異質(zhì)性原發(fā)性支氣管上皮腫瘤，我們選擇HBE細(xì)胞作為對(duì)照組。圖像顯示Trop2散射在所有細(xì)胞膜上，其中一些形成熒光斑點(diǎn)，但無(wú)法清晰區(qū)分（圖1a-d）。然而，重建的dSTORM圖像顯著提高了分辨率（圖1e-h）。我們觀察到HBE細(xì)胞膜上只有少數(shù)Trop2，而在三種類型的NSCLC細(xì)胞膜上則有大量Trop2。此外，放大后的圖片詳細(xì)顯示了Trop2的異質(zhì)分布（圖1i-l）。

圖 1.Trop2在不同細(xì)胞系上的dSTORM成像，四種細(xì)胞膜上Trop2的TIRF圖像：（a）HBE，（b）A549，（c）H460和（d）SK-MES-1。（e–h）在這四個(gè)細(xì)胞膜上相應(yīng)的重建的Trop2的dSTORM圖像。（i-l）白色框框顯示的 Trop2 dSTORM 圖像的放大視圖。比例尺：5 μm（e–h） 和 1 μm（i–l）

2.通過(guò)SR-Tesseler方法對(duì)Trop2進(jìn)行聚類分析

除了獲得Trop2的高分辨率圖像外，使用合適的方法來(lái)定量分析蛋白質(zhì)的空間分布同樣重要。到目前為止，各種分析方法已被應(yīng)用于超分辨率成像數(shù)據(jù)，例如Ripley's K函數(shù)，DBSCAN （基于密度的噪聲空間聚類分析），H-SET [36]（分層單發(fā)射器假設(shè)檢驗(yàn)）和FOCAL （用于定位的快速優(yōu)化聚類算法）。每種算法都有自己的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用范圍。在這里，我們使用了一種新的圖形處理方法SR-Tesseler，它可以精確地分割定位并提取集群的信息。

圖 2. SR-Tesseler分析示意圖

（a）在HBE細(xì)胞膜上重建的Trop2的dSTORM圖像。細(xì)胞膜用紅線圈出“ROI”。（b） 閃爍校正后的 dSTORM 圖像。（c） 由許多多邊形組成的沃羅諾伊圖。（d） 對(duì)每個(gè)多邊形的局部化密度進(jìn)行閾值化提取的藍(lán)色區(qū)域（e） 提取的簇（綠色）的定位密度高于對(duì)象的平均密度。（f-h） 圖（c–e）框在中的多邊形、對(duì)象和聚類的放大圖像。比例尺：4 μm（a–e） 和 300 nm（f–h）。

3.Trop2 在原發(fā)性肺癌細(xì)胞上的顯著簇分布

為了進(jìn)一步探索和驗(yàn)證Trop2簇在原代細(xì)胞上的分布特征，我們選擇人原發(fā)性肺腺癌細(xì)胞作為NSCLC的代表，配對(duì)原代正常肺上皮細(xì)胞作為對(duì)照。與培養(yǎng)細(xì)胞一致，dSTORM圖像顯示Trop2過(guò)度表達(dá)并在肺癌細(xì)胞上形成大簇，而在正常肺細(xì)胞上存在相對(duì)較少的蛋白質(zhì)和小簇（圖3a-f）。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，Trop2在癌細(xì)胞上的定位密度幾乎是正常細(xì)胞的兩倍（圖3g）。SR-Tesseler分析還證明了聚類特征的顯著差異。癌細(xì)胞上的簇面積和簇?cái)?shù)都遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞上的簇面積和簇?cái)?shù)（圖3h-i）。此外，癌細(xì)胞具有更密集的簇，由200多個(gè)定位組成，而對(duì)于不超過(guò)100個(gè)定位的小簇，正常細(xì)胞占更大的比例（圖3j）。結(jié)果與從A549和HBE細(xì)胞獲得的結(jié)果一致。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了Trop2與肺癌的腫瘤發(fā)生有關(guān)，其過(guò)表達(dá)和聚集分布可能使其成為肺癌診斷的良好標(biāo)志物。

圖 3.原發(fā)性肺腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞上的 Trop2 分布通過(guò) dSTORM 成像顯示

（甲至乙）（a）原發(fā)性肺癌細(xì)胞和（b）正常肺細(xì)胞上的Trop2的TIRF圖像。（c–d）同一細(xì)胞膜上的相應(yīng)dSTORM圖像。（e–f）圖（c–d）白色框框的 dSTORM 圖像的放大視圖。比例尺：5 μm（c–d） 和 1 μm（e–f）。（g）Trop2在這兩種細(xì)胞上的定位密度。（h） 不同細(xì)胞膜上的團(tuán)簇標(biāo)準(zhǔn)化。（i） 每平方微米的團(tuán)簇?cái)?shù)（j） 團(tuán)簇百分比。所有結(jié)果均來(lái)自五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的十個(gè)細(xì)胞樣品。采用雙尾不配對(duì)t檢驗(yàn)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.0001，ns 表示不顯著。

結(jié)論

綜上所述，利用STORM觀察了Trop2在NSCLC細(xì)胞和正常細(xì)胞（培養(yǎng)細(xì)胞和原代細(xì)胞）膜上的分布格局，并利用SR-Tesseler分析了其聚集特征。我們發(fā)現(xiàn)Trop2在癌細(xì)胞上的表達(dá)和聚集水平高于正常細(xì)胞，這表明Trop2在癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)和聚集的共同特征，這將有助于早期癌癥診斷。盡管Trop2簇存在于所有肺癌細(xì)胞中，但值得注意的是，不同種類的癌細(xì)胞之間的團(tuán)簇性質(zhì)不同。例如，A549和H460細(xì)胞具有相對(duì)更多的簇，而SK-MES-1細(xì)胞具有與HBE細(xì)胞相似的簇?cái)?shù)。我們的研究結(jié)果為癌癥相關(guān)蛋白（如Trop2）聚集的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解，并有利于開(kāi)發(fā)針對(duì)癌癥中Trop2的新藥。