隧道納米管（TNTs）是一種納米級的、富含肌動蛋白的、用于細(xì)胞間通訊的瞬時細(xì)胞間管。結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和空間組織所涉及的組成部分的TNTs仍然未知。在本次研究中，STORM超分辨率成像技術(shù)被運用到結(jié)構(gòu)組織的微絲和微管在細(xì)胞間的TNT在納米尺度上。作者的研究結(jié)果揭示了不同的分布的微絲和交織結(jié)構(gòu)的微管在TNT，促進(jìn)TNT通信。

研究背景

細(xì)胞-細(xì)胞通信是通過多種機(jī)制發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞活動，例如突觸、間隙連接、突觸橋和隧道納米管（TNT）。在過去十年中，科學(xué)研究人員描述了TNTs在許多細(xì)胞類型中的重要生物學(xué)功能。此外，最近的研究還強(qiáng)調(diào)了TNTs在一些疾病中的重要作用，如神經(jīng)退行性疾病、癌癥診斷、免疫學(xué)和病毒學(xué)。雖然發(fā)現(xiàn)TNT參與關(guān)鍵的生物學(xué)和病理學(xué)過程，但TNT的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性在很大程度上仍然未知。揭示TNT相關(guān)成分的空間組織可以促進(jìn)對其細(xì)胞功能以及如何調(diào)節(jié)疾病的了解。超分辨率技術(shù)超越了衍射極限，使可視化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)在前所未有的空間分辨率。在這些技術(shù)中，基于單分子定位的隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）由于其出色的空間分辨率和簡單的操作而在生物學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用。在這里，作者報告的直接觀察TNTs依靠在納米尺度上的STORM成像技術(shù)。超分辨率成像用于不同TNT中微管的不同結(jié)構(gòu)和分布的可視化，并利用三維（3D）STORM成像探索TNT中微管的空間組織。此外，線粒體分布和TNT形態(tài)之間的潛在關(guān)系進(jìn)行了進(jìn)一步研究，這是有助于闡明線粒體在TNT的交付模式。STORM技術(shù)的這種一般方法為進(jìn)一步研究TNT開辟了無數(shù)的可能性。

研究結(jié)果（部分）

如上所述，TNT是一種類型的肌動蛋白支持的細(xì)胞突起，其在不同大小范圍內(nèi)具有不同類型。為了更好地理解不同類型的TNT之間的差異，作者利用STORM技術(shù)在BS-C-1細(xì)胞中以不同的視野對不同大小的TNT中的微抗體進(jìn)行成像，如圖1所示，在STORM成像中采用10分鐘的透化時間以記錄TNT中的微物質(zhì)。

圖1 不同視野下BS-C-1細(xì)胞間TNT中微絲的超分辨率成像

(A-C)微絲的代表性全視場寬視場圖像（左）和加框區(qū)域的放大圖像（右）。(D-F)方框區(qū)域的相應(yīng)STORM圖像（左）。放大的圖像（中間）顯示了微絲的詳細(xì)分布。紅線顯示STORM圖像的放大圖片中箭頭指向區(qū)域的橫截面輪廓（右側(cè)）的高斯擬合。接下來，作者測量了來自亮視圖圖像的TNT的寬度，并將結(jié)果與共焦圖像中最外面的微陣列之間的間隙進(jìn)行比較（圖1B）。作者發(fā)現(xiàn)，TNTs的寬度通常略大于相應(yīng)的微陣列的間隙。這一結(jié)果表明，微量元素傾向于定位在TNT管腔的兩側(cè)。然后，作者應(yīng)用STORM成像來可視化TNT中微物質(zhì)的詳細(xì)分布。圖中的STORM超分辨率圖像中，圖1D-F顯示了TNT中更清晰的微污染物分布。此外，很明顯，隨著最外微構(gòu)件差距增大（從0.09mm到1.17mm，圖1B），最外微構(gòu)件的間隙增大（從0.09mm到1.17mm）。如圖1D-F所示，在TNT中存在更多的微孔，并且在TNT的中空部分中出現(xiàn)更薄和更直的微孔?？傊@些結(jié)果表明，隨著TNT的尺寸變大，其中的微泡數(shù)量增加，表明細(xì)胞通訊之間的膜附著不同。微管作為另一種重要的細(xì)胞骨架成分，存在于納米管的胞質(zhì)通道中，并構(gòu)成了致密的TNT網(wǎng)絡(luò)。作者采用STORM成像以不同的視野觀察BS-C-1細(xì)胞的TNT中微管的組織（圖1）。通過抗α-微管蛋白單克隆抗體和Alexa Fluor? 647偶聯(lián)的第二抗體實現(xiàn)微管的染色。作者觀察到TNT中的微管蛋白，如圖1B所示。圖2A-C也顯示了細(xì)胞間的喇叭狀連接。作者發(fā)現(xiàn)微管在TNT中的分布明顯地組織起來，如圖所示。圖2A-C。微管的分布寬度在0.29 ~ 4.58mm之間。當(dāng)TNT變寬時，會出現(xiàn)更多的微管，其中一些微管以交織的方式沿著管壁延伸。

圖2 STORM超分辨率成像顯示微管在不同細(xì)胞中的不同分布

代表性的寬視場圖像和每張圖片中緊挨著寬視場圖像的對應(yīng)STORM圖像指示具有不同直徑的TNT中微管的各種組織模式。(A-C)BS-C-1細(xì)胞中TNT微管在不同視野中的超分辨率成像。放大圖像顯示詳細(xì)信息。(D-F)三種類型癌細(xì)胞中TNT微管的超分辨率成像：食管癌細(xì)胞KYSE 150（D）、宮頸癌細(xì)胞HeLa（E）和人骨肉瘤細(xì)胞U2 OS（F）。除了BS-C-1細(xì)胞外，作者還對各種癌細(xì)胞中的細(xì)胞間微管進(jìn)行了成像，包括食管癌細(xì)胞KYSE 150、宮頸癌細(xì)胞HeLa和人骨肉瘤細(xì)胞U2 OS，這些細(xì)胞通常用于研究實驗室中的生理和病理過程?？傊鲜鼋Y(jié)果說明了不同細(xì)胞中TNT中微管的不同組織模式。為了詳細(xì)研究微管的組織模式，必須通過3D成像來觀察它們。如上所述，微管傾向于在TNT中纏結(jié)。為了更清楚地了解微管在TNT中如何扭曲，進(jìn)一步應(yīng)用3D-STORM成像來分析微管的詳細(xì)組織。超分辨率圖像顯示，在較小直徑的TNT中，至少有三個微管相互纏繞（圖3A），并且更多的微管也在具有較大直徑的TNT中顯示出纏結(jié)組織（圖3A、3B），沿著更高分辨率的STORM圖像和直觀的3D成像結(jié)果，超分辨率圖像顯示這些微管以有序的螺旋纏繞方式纏繞在一起。

圖3 分別具有較?。ˋ）和較大（B）直徑的TNT中微管的3D超分辨率成像

為了更好地理解通過TNT的線粒體轉(zhuǎn)移，作者在這里使用STORM成像來研究TNT內(nèi)線粒體的空間分布。我們首先觀察了線粒體在兩個相鄰細(xì)胞之間的分布，并在明亮的視圖圖像中觀察到兩個細(xì)胞之間明顯的管狀結(jié)構(gòu)，如圖所示，線粒體傾向于分布在靠近細(xì)胞兩側(cè)的區(qū)域，而在TNT的中間區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)明顯的線粒體。然后，我們應(yīng)用雙色成像觀察微管和線粒體在TNT同時使用顯微鏡。共定位圖像顯示大部分線粒體集中在TNT中細(xì)胞的芽狀側(cè)上，這與圖1B中所示的STORM結(jié)果一致。

圖4 明視圖、寬視野和STORM圖像

研究小結(jié)

綜上所述，作者應(yīng)用STORM超分辨成像方法來探索TNT組分在納米尺度的結(jié)構(gòu)和分布。微管和微管的不同組織模式說明了TNT形成的不同結(jié)構(gòu)模式、STORM成像從直觀方面呈現(xiàn)了TNT中微管的清晰交織結(jié)構(gòu)。此外，在TNTs中觀察到明顯的線粒體分布，表明TNTs在細(xì)胞間具有運輸功能。作者的數(shù)據(jù)提供了一個新的框架，未來的研究TNT的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。隨著超分辨成像技術(shù)和標(biāo)記方法的快速發(fā)展，作者肯定了TNTs結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性將在未來得到快速驗證。