為了在血管功能中作為血流的機(jī)械傳感器和作為經(jīng)血管交換的屏障發(fā)揮不同的作用，內(nèi)皮表面糖萼（ESG）應(yīng)該具有有組織的結(jié)構(gòu)。由于光學(xué)和電子顯微鏡的局限性，直到最近發(fā)展的超分辨光學(xué)顯微鏡STORM才揭示了ESG的超微結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：HA是一種長(zhǎng)鏈分子，編織成網(wǎng)狀覆蓋在內(nèi)皮細(xì)胞表面.相比之下，HS是垂直于細(xì)胞表面的較短分子。HA和HS在內(nèi)皮管腔表面彼此部分重疊。研究者還定量了內(nèi)皮表面頂部、中部和底部區(qū)域的HS的長(zhǎng)度、直徑、方向和密度。

#01導(dǎo)言

排列在我們血管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞（EC）的腔表面包被有由蛋白聚糖和糖胺聚糖（GAG）組成的膜結(jié)合大分子的糖萼。由于其獨(dú)特的位置，在循環(huán)血液和血管壁的界面處，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ESG在維持正常血管功能方面起重要作用。因此，自20世紀(jì)60年代以來(lái)，通過(guò)各種方法對(duì)其組成、結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能進(jìn)行了廣泛的研究。然而，由于空間分辨率的限制或樣品制備過(guò)程中的人為因素，靜電陀螺儀的空間化學(xué)組織仍然不清楚。最近開(kāi)發(fā)的隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）是三種類型的單分子定位顯微鏡之一，采用有機(jī)染料和熒光蛋白作為光可切換發(fā)射器，以將時(shí)間分辨率轉(zhuǎn)換為超空間分辨率，這比傳統(tǒng)的顯微鏡高一個(gè)數(shù)量級(jí)。STORM和其他類型的超分辨率光學(xué)顯微鏡能夠在納米尺度上發(fā)現(xiàn)和研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從單個(gè)蛋白質(zhì)到天然細(xì)胞環(huán)境中的整個(gè)細(xì)胞器。ESG的作用基于其分子組成和組織。ESG的組成部分已在中進(jìn)行了深入研究。ESG主要由帶有短酸性寡糖和末端唾液酸（SA）的糖蛋白和蛋白聚糖（PG）如硫酸乙酰肝素PG（HSPG）（包括具有長(zhǎng)糖胺聚糖（GAG）側(cè)鏈的多配體聚糖和磷脂酰肌醇聚糖核心蛋白）組成。帶負(fù)電荷的GAG結(jié)合蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子、陽(yáng)離子和其他血漿組分。血管EC中的主要GAG是硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸軟骨素（CS）和透明質(zhì)酸（HA）。在這三者中，最豐富的是HS，占總GAG的50-90%，其余由CS、HA和SA組成。HS和CS與PG共價(jià)結(jié)合，而HA不與PG核心蛋白結(jié)合。HA是一種非硫酸化GAG，其與其表面受體CD 44和HA介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性受體（RHAMM）結(jié)合。除了其生化組成外，ESG的厚度和超微結(jié)構(gòu)決定了其功能。通過(guò)電子顯微鏡（EM）對(duì)ESG的第一次可視化使用陽(yáng)離子染料釕紅，其結(jié)合酸性粘多糖并在四氧化鋨存在下產(chǎn)生電子密度。隨后的研究使用金膠體和免疫過(guò)氧化物酶標(biāo)記。Adamson和Clough然后使用大的帶電標(biāo)記蛋白（無(wú)法穿透ESG），陽(yáng)離子化鐵蛋白（分子量≈ 450 kDa）證明，在不存在血漿蛋白的情況下，ESG會(huì)崩潰，可能是由于消除了與血漿蛋白的分子內(nèi)相互作用，并且其未受干擾的厚度比釕紅觀察到的20 nm大幾倍。所有這些方法都可能遭受與水性固定劑相關(guān)的脫水假象，水性固定劑可能溶解除蛋白聚糖的蛋白質(zhì)核心之外的所有蛋白質(zhì)，并破壞固有的水合結(jié)構(gòu)。研究人員開(kāi)發(fā)了一種使用碳氟化合物作為四氧化鋨的非水載體來(lái)保存水溶性結(jié)構(gòu)的方法，該方法被應(yīng)用于微血管，以消除其中的一些限制。Rostgaard和Qvortrup對(duì)碳氟化合物-戊二醛固定方法的進(jìn)一步闡述揭示了毛細(xì)血管壁上的絲狀刷狀表面涂層，但層厚度小于50 nm，表明更表面的基質(zhì)結(jié)構(gòu)裂解。所有前述EM研究揭示具有小于IOOnm的厚度的ESG。最近研究者發(fā)現(xiàn)大鼠左心室心肌毛細(xì)血管上的ESG厚度為0.2-0.5 μm。活體光學(xué)顯微鏡的差的空間分辨率限制了ESG厚度的準(zhǔn)確測(cè)量。因此，通過(guò)采用激光掃描共聚焦顯微鏡和多光子顯微鏡，以及針對(duì)HS或HA結(jié)合蛋白或麥胚凝集素的熒光標(biāo)記抗體來(lái)標(biāo)記ESG的主要組分，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了新的成像方法。這些新方法的應(yīng)用揭示了大血管中厚得多的ESG：在小鼠頸總動(dòng)脈中為4.3-4.5 μ π ι ，在小鼠頸內(nèi)動(dòng)脈中為2.2 μ π ι ，在頸外動(dòng)脈中為2.5 μ π ι 。Ebong等人首次展示了體外靜電陀螺儀的冷凍電鏡圖像，該圖像避免了常規(guī)電鏡的脫水偽影，并觀察到厚度大于5 μm（最大可達(dá)11 μm）的結(jié)構(gòu)。最近，使用高靈敏度和分辨率共聚焦顯微鏡和原位/體內(nèi)單微血管和離體主動(dòng)脈免疫染色，Yen等人揭示了大鼠腸系膜和小鼠提睪肌毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后小靜脈上ESG的厚度為1-1.5 μm。大鼠和小鼠主動(dòng)脈的ESG厚度為2-2.5 μ m。Betteridge等人通過(guò)比較在體內(nèi)單個(gè)微血管中質(zhì)膜標(biāo)記和麥胚凝集素（WGA）標(biāo)記ESG（SA殘基）之間的距離，發(fā)現(xiàn)與Yen等人相同類型的微血管中ESG厚度為0.17-3.02 μm，這取決于標(biāo)記和分析方法。ESG的超微結(jié)構(gòu)組織及其與細(xì)胞骨架組分的關(guān)系（使用電子斷層掃描進(jìn)行3D重建得到證實(shí)。通過(guò)他們的EM方法觀察到的ESG的厚度為? 100nm，類似于先前在青蛙腸系膜微血管上發(fā)現(xiàn)的厚度。克服脫水工件在新興市場(chǎng)和傳統(tǒng)的空間分辨率的限制,在目前的研究中,通過(guò)使用STORM,研究者發(fā)現(xiàn)第一次超限分辨圖像ofHS和HA組件的環(huán)境、社會(huì)和治理在支架表面培養(yǎng)bEnd3老鼠大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層,并量化ultra-structural參數(shù)ofHS和直徑HA在EC支架表面的不同區(qū)域。

#02實(shí)驗(yàn)方法

2.1樣品制備

細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（bEnd 3），來(lái)自ATCC（Manassas，VA）在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基/營(yíng)養(yǎng)混合物F-12 Ham培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（DMEM/F-12）、2 mM L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素和1 mg/mL鏈霉素（均來(lái)自Sigma-Aldrich，St. Louis，MO），補(bǔ)充有10%胎牛血清，并在37 °C下在具有5%C02的潮濕氣氛中孵育。免疫熒光染色：將bEnd 3細(xì)胞胰蛋白酶化并以600個(gè)細(xì)胞/mm 2的密度接種在50 yg/mL纖連蛋白包被的1.5號(hào)玻璃底培養(yǎng)皿上并培養(yǎng)3-4天直至匯合。然后用1%BSA/PBS輕輕洗滌細(xì)胞，用2%多聚甲醛和0.1%戊二醛固定20分鐘，用0.1%NaBH4還原7分鐘，用1%BSA/PBS洗滌3次，并用2%正常山羊血清（NGS）封閉30分鐘。對(duì)于HS染色，將固定的細(xì)胞與小鼠抗硫酸乙酰肝素10 e4在4 ℃孵育過(guò)夜，然后與ATTO 488綴合的山羊抗小鼠IgG孵育;對(duì)于HA染色，將固定的細(xì)胞與生物素化的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白在4 °C孵育過(guò)夜，然后與Alexa Fluor 647綴合的抗生素孵育。最后，將樣品用2%多聚甲醛和0.1%戊二醛后固定10分鐘，然后保持在1%BSA/PBS中。

2.2STORM圖像采集

使用STORM對(duì)樣品進(jìn)行成像。使用由405 nm波長(zhǎng)激光以交替照明激活的ATTO 488和Alexa Fluor 647的多個(gè)報(bào)告物來(lái)獲取HS和HA的3D圖像?；诿總€(gè)報(bào)告子以19 ms/幀的捕獲速度捕獲的40，000個(gè)ofEM-CCD圖像，獲得細(xì)胞頂端（腔）表面上的三個(gè)256 × 256（40 × 40 μm2）的HS和HA視野，位于頂部、中部和底部。頂部區(qū)域聚焦于細(xì)胞核上方的細(xì)胞表面，底部區(qū)域聚焦于兩個(gè)相鄰細(xì)胞的谷，中間區(qū)域聚焦于頂部和底部區(qū)域中間的平面。閃爍點(diǎn)的原始圖像電影由伴隨STORM系統(tǒng)的分析軟件處理，并在圖1中展示。

2.3數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用單發(fā)射器質(zhì)心算法來(lái)估計(jì)數(shù)據(jù)電影中激活的熒光團(tuán)的3D位置，并產(chǎn)生3D STORM圖像，其空間分辨率分別為側(cè)向平面中的20nm和軸向方向上的50nm。通過(guò)使用混合高斯模型從STORM圖像估計(jì)細(xì)胞表面上的組分中的地面實(shí)況熒光團(tuán)位置。然后，在估計(jì)的熒光團(tuán)位置的基礎(chǔ)上估計(jì)組件的超微結(jié)構(gòu)參數(shù)。對(duì)于HS元件，我們假設(shè)它是一個(gè)圓柱體，其等效直徑具有與真實(shí)的形狀相同的橫截面積（橢圓狀）。其他超微結(jié)構(gòu)參數(shù)、長(zhǎng)度、HS的取向和相鄰HS元件之間的距離（中心到中心）在圖2的插圖中定義。由于難以識(shí)別在細(xì)胞腔表面處編織成網(wǎng)絡(luò)的單個(gè)HA元件，我們從圖3中所示的HA區(qū)段的2D圖像估計(jì)HA直徑。

#03研究結(jié)果

3.1HS和HA的組織

圖1A-C展示了STORM揭示的HS和HA的組織。圖1A是在頂部區(qū)域觀察到的，圖1B是在中間區(qū)域觀察到的，圖1C是在細(xì)胞腔（頂端）表面的底部區(qū)域觀察到的。對(duì)于所有圖，第二列是HS圖像（綠色），第三列是HA圖像（紅色），第一列是第二列和第三列的疊加。第一行是2D頂視圖，第二行是34 μm × 34 μm視場(chǎng)的3D視圖。第三和第四行是第一行中具有綠色虛線的區(qū)域的放大的2D和3D視圖。第五和第六行是來(lái)自第三行中具有藍(lán)色虛線的區(qū)域的進(jìn)一步放大的2D和3D視圖。第二列和第三列中三維視圖左側(cè)的顏色條表示長(zhǎng)度比例。從這些圖中可以看出，HA（紅色）是編織成2D網(wǎng)絡(luò)片的長(zhǎng)分子，其覆蓋細(xì)胞腔表面并且與細(xì)胞腔表面在同一平面中。相比之下，HS是垂直于細(xì)胞腔表面的較短分子。HS和HA在細(xì)胞腔表面部分重疊。

3.2HS超微結(jié)構(gòu)參數(shù)和HA直徑

圖1 STORM揭示的ESG成分和超微結(jié)構(gòu)

HS和HA在單元(A),在細(xì)胞細(xì)胞底部中間(B)和(C)從細(xì)胞腔的表面。所有的插圖,第二列是HS圖像(綠色),第三列是HA圖像(紅色)和第一列是第二和第三列的疊加。第一行是2 d頂視圖,第二行是3 d視圖的字段～34μm×34μm。第三和第四行放大2 d和3 d視圖從該地區(qū)綠色虛線的第一行。第五和第六行進(jìn)一步擴(kuò)大2 d和3 d視圖從該地區(qū)的藍(lán)色虛線第三行。左邊的顏色條的3 d視圖HS(第二列)和HA(第三列)代表深度(長(zhǎng)度)。

表1 bEnd3細(xì)胞腔表面HS超微結(jié)構(gòu)的定量

表2 在bEnd3細(xì)胞腔表面的HA直徑

表2總結(jié)了HA直徑估計(jì)從2 d圖像圖3所示。直徑是185.3±44.7 nm, 155.5±57.2 nm,和156.9±56.1 nm,分別在頂部、中部和底部區(qū)域的細(xì)胞腔的表面。這在HA直徑?jīng)]有顯著差異這三個(gè)地區(qū)(p > 0.1)。比較HA直徑與HS直徑?jīng)]有區(qū)別哈哈直徑和HS直徑頂部和底部區(qū)域(p > 0.2),但在中部地區(qū)有顯著差異(p < 0.01)。

#04討論

使用STORM，研究者揭示了在納米尺度的bEnd 3單層的ESG中HS和HA的空間化學(xué)組織。直接和間接證據(jù)表明，ESG在維持血管功能方面至少發(fā)揮三種重要作用。

1)它可以作為EC的機(jī)械傳感器和換能器來(lái)感知血流；

2）它通過(guò)形成分子篩維持正常的微血管通透性，允許水和小分子通過(guò)但限制血漿蛋白等大分子;

3）它在循環(huán)紅細(xì)胞（RBC）和形成血管壁的EC之間產(chǎn)生潤(rùn)滑緩沖液以避免RBC損傷，并產(chǎn)生屏障以防止循環(huán)白細(xì)胞、血小板和腫瘤細(xì)胞粘附到血管壁。它還屏蔽EC表面受體，防止其超活化。

STORM揭示的ESG中HS和HA的組織和分布為ESG扮演這三個(gè)角色提供了直接的結(jié)構(gòu)可行性。HS元件垂直于細(xì)胞腔表面，能夠感測(cè)血流并用作EC的機(jī)械傳感器和換能器。在細(xì)胞腔表面的底部處的更密集的HS分布（其可以覆蓋細(xì)胞間連接）沿著由HA形成的編織網(wǎng)絡(luò)有利于ESG成為用于經(jīng)血管交換的分子篩、循環(huán)細(xì)胞和形成血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞粘附的屏障以及EC表面受體的屏障。