我們通過M-β-CD處理細胞，破壞細胞表面的脂筏結構，對比正常細胞和經(jīng)M-β-CD處理后的細胞頂端膜上的分布變化，進而得出了脂筏存在對糖分子分布的影響。所研究的糖分子包括Sia、oligosaccharide (Galβ1-4GlcNAcβ1-2 (Galβ1-4GlcNAcβ1-6) Manα1-R)、Fuc、Man、Gal、和GalNAc。相比正常細胞表面的糖分子分布形貌（圖1A-F-左），我們發(fā)現(xiàn)在膽固醇被抽提的細胞表面（圖1A-F-右），無論哪種類型的糖分子都發(fā)生了顯著的分布變化：從原始的重構圖上點分布的強度變化可以明顯看出，隨著脂筏被破壞，大量的糖分子分布減少；另外，從放大的超分辨圖像上，能夠更加清晰地觀察到這些糖分子簇明顯減少、變小，取而代之的是更多的散點分布。各糖分子都有的巨大分布變化以及它們統(tǒng)一的變化趨勢表明了細胞膜上所有類型的糖分子簇的穩(wěn)定存在都和脂筏的完整存在有著密不可分的聯(lián)系。
為闡明肌動蛋白骨架是否在控制糖分子簇大小方面起著重要作用，我們觀察了細胞骨架被破壞后，細胞表面糖分子的分布變化。通過CB處理Vero細胞使其肌動蛋白骨架結構被破壞，進而利用dSTORM成像技術觀察了破壞后的糖分子分布形態(tài)。對比正常細胞膜表面的七種糖分子分布的超分辨重構圖（圖2A-G-左），很明顯地，在骨架被破壞的細胞表面，大多數(shù)類型的糖分子簇分布都失去了清晰的邊緣，面積增大，彼此相連。進一步，通過成對累積分布函數(shù)（pairwise cumulative distribution function，CDF）分析方法對膜上糖分子的分布進行了檢測。理論上，單分子定位成對距離的CDF會隨著密實結構域的納米結構發(fā)生變化。在給定的空間距離內(nèi)，有著大尺度成簇的數(shù)據(jù)其成對距離會小于那些小尺度成簇的。也就是說，CDF曲線會隨著分子成簇距離的增大而向右移動。從我們的分析結果來看（圖2H），CB處理后，有著密實成簇的糖分子（Sia，oligosaccharide，F(xiàn)uc和GlcNAc）的CDF發(fā)生了明顯的右移；而松散成簇的糖分子的CDF也發(fā)生了輕微右移。這一結果表明在失去了肌動蛋白骨架的限制作用后，糖分子不再聚集在特定區(qū)域而是分散在更大的幾乎無邊界的塊斑中，特別是對于那些原本密實成簇的糖分子。另外，我們也應用了改善的Hopkin檢測對這些超分辨中的納米結構域的圖心進行了分析。Hopkin統(tǒng)計分析的結果和CDF的是類似的。正常細胞和骨架被破壞的細胞表面糖分子分布的Hopkin函數(shù)值之間的明顯差異表明沒有了肌動蛋白骨架的限制，糖分子變得稀疏地分散在更大的塊斑中。

   圖1：多種糖分子在正常Vero細胞和經(jīng)M-β-CD處理后的細胞頂端膜上的超分辨圖。（A-F）通過Alexa647偶聯(lián)的不同lectins作為特異性的熒光探針標記被充分固定的正常的（左）和經(jīng)M-β-CD處理的Vero細胞（右），得到的各糖分子的代表性dSTORM重構圖。目標糖分子依次為：Sia（A）、oligosaccharide（B）、Fuc（C）、Man（D）、Gal（E）、GalNAc（F）。來自原始重構圖中方框區(qū)域的放大圖更加清晰地呈現(xiàn)了糖分子簇形態(tài)變化。原始重構圖中標尺為5 μm；放大圖中標尺為500 nm。
另外，我們也統(tǒng)計分析了骨架被破壞后糖分子簇的平均簇面積和簇覆蓋率的變化情況（圖3），發(fā)現(xiàn)每種糖分子隨著骨架限制作用的消失都表現(xiàn)出了明顯的簇面積增大和簇覆蓋率增加。這也再次表明了肌動蛋白骨架結構對糖分子簇的特定大小發(fā)揮著限制作用。
   

  圖2. 各種糖分子在正常細胞和經(jīng)CB處理后的細胞表面分布變化的對比分析。（A-G）糖分子（Sia (A), oligosaccharide (B), Fuc (C), Man (D), Gal (E), GalNAc (F)和GlcNAc (G)）在正常細胞（左）和處理后的細胞（右）表面分布的代表性dSTORM重構圖，標尺為2 μm。（H）七種糖分子在正常細胞和CB處理后的細胞表面分布的成對累積分布函數(shù)（CDF）對比圖。（I）對目標糖分子簇中心的空間隨機性的改善性Hopkin檢測結果圖。紅色函數(shù)曲線表示的是隨機分布，其峰值所對應的Hopkin統(tǒng)計值為0.5。
 
                                  圖3. 正常細胞和經(jīng)CB處理后的細胞表面各糖分子的平均簇面積（A）和簇覆蓋率（B）的對比分布圖。

   利用dSTROM成像技術，我們系統(tǒng)地研究了七種代表性糖分子在不同的正常細胞和癌細胞表面的分布形態(tài)。相比293FT（人胚腎細胞）細胞表面，這些所研究的糖分子在Os-Rc-2（人腎癌細胞）細胞表面不僅有著更高的表達水平，而且呈現(xiàn)出獨特的分布形態(tài)（尤其是以更大的簇面積和更高的簇覆蓋率分布），這表明這些有著獨特分布的糖分子能夠作為腎癌細胞的潛在生物標記物。另外，由于Sia在293FT/Os-Rc-2細胞的研究中呈現(xiàn)出中等水平的分布差異，被選作代表性糖分子進行了Sia在原代腎癌細胞和正常腎細胞表面的分布成像，發(fā)現(xiàn)在多個分析參數(shù)上，臨床生物樣品所得結果均和細胞系的沒有差異，這表明目標糖分子的顯著性分布差異有很大潛力成為新穎的臨床癌癥檢測的標記物。此外，大多數(shù)目標糖分子（如oligosaccharide、Sia、GlcNAc、Gal和GalNAc）在Hela細胞（人宮頸癌細胞）和Os-Rc-2細胞表面都有著相似的分布形態(tài)，這表明糖分子在癌細胞上的異常分布很可能是不同癌細胞共有的特征。我們進一步選擇了有著中等水平分布差異的Sia作為代表性糖分子，研究了其在多種正常細胞和癌細胞表面的分布特征，發(fā)現(xiàn)相比不同的正常細胞，Sia在不同的癌細胞表面均表現(xiàn)出了相似的簇面積增大和簇覆蓋率升高的分布趨勢。然而，細胞表面糖分子的表達水平和簇密度卻沒有在多種正常細胞和癌細胞間表現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律，因此，一些傳統(tǒng)的分析方法（如質譜和普通的熒光成像）并不能檢測到癌癥相關的糖分子變化。而我們的發(fā)現(xiàn)表明有著超高分辨率的dSTORM成像技術能夠檢測到多種癌細胞表面的糖分子分布差異，從而基于癌細胞表面糖分子獨特的分布特征（尤其是簇大小和簇覆蓋率）能夠更好地確定腫瘤的發(fā)生。再者，這些癌癥相關的糖分子異常分布來源于癌細胞膜上糖綴合物組裝的整體改變，這表明癌癥相關的改變很可能表現(xiàn)在配體的密度、反應分子的可接觸性、功能蛋白或脂類的構象或寡聚化的變化等等。因此，癌細胞形成正常細胞上極少出現(xiàn)或根本不會出現(xiàn)的獨特膜組裝很可能是為了促進癌癥的發(fā)生與轉移。盡管這些推測還有待進一步驗證，但我們關于癌癥相關的糖分子異常分布的發(fā)現(xiàn)確實可以為癌癥的研究提供一些新觀點新思路，這也將促進對癌癥發(fā)生和轉移中糖基化改變的潛在機理的研究。